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【技术规程】大型真菌菌种保藏技术规程

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国家自然科技资源平台大型真菌菌种保藏技术规程(试行)


《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组


二〇〇四年十二月十日

目    次

前  言…………………………………………………………………………………………2

引  言…………………………………………………………………………………………3

1范围…………………………………………………………………… ……………………4

2术语与定义………………………………………………………………………………… 4

3原理……………………………………………………… …………………………………4

4技术要求………………………………………………… …………………………………4

5方法与步骤……………………………………………… …………………………………5

参考文献………………………………………………………………………………………9

前    言

本规程由国家自然科技资源平台建设项目提出。

本规程起草单位:中国农业科学院土壤肥料研究所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国兽医药品监察所、中国食品发酵工业研究院。

本规程主要起草人:淮稳霞、朴春根、姜瑞波、顾金刚、周宇光、叶强、张月琴、陈敏、程池等。

引  言

大型真菌是菌物中的一个重要类群,很多种类具有较高的营养价值和药用价值,是目前菌物中最有开发应用前景的一类;此外,一些大型真菌能够分解枯死植物,对维持自然界物质循环、生态平衡有重要的作用,可开发应用于造纸业和环境净化;一些大型真菌能引起树木病害或损害多种木质产品,对此类病原真菌的认识的加强,有利于预防和减少危害的发生。大型真菌的规范性保藏对于微生物菌种资源的安全、高效保藏及共享具有重意义

制订科学、适用的大型真菌菌种保藏技术规程对长期有效保藏遗传资源、异地保藏生物多样性具有重要的价值和意义。

大型真菌菌种保藏技术规程

1范围

本规程规定了大型真菌菌种保藏的基本原则、方法及技术要求。

本规程适用于各类大型真菌菌种的保藏。

2术语与定义

2.1

大型真菌 macrofungi

大型真菌是菌物中形成大型子实体的一类真菌,泛指广义上的蘑菇或蕈菌。

2.2

程控降温controlled rate freezing

根据预设程序控制降温,使生物样品稳定、连续、分段降温的过程。

2.3  

液氮超低温保藏 preservation in liquid nitrogen

液氮超低温保藏技术是将菌种在-196℃的液态氮,或在-150℃的气态氮中长期保藏的方法,其原理是利用生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

3原理

菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,以达到最大限度地降低菌种的代谢强度,抑制菌丝的生长和繁殖,使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态,从而延长菌种的保藏时间。

4技术要求

4.1不同菌种应根据要求选择适合的培养基进行培养。

4.2接种须无菌操作,避免杂菌污染。

4.3定期检查

保藏期间要定期检查保藏菌种的冰箱温度和湿度;检查保藏器皿的棉塞有无生霉现象,如发现异常则立即取出该管重新纯化,经培养后补上空缺;在低倍解剖镜下抽样检查有无螨虫等害虫,发现时须及时消除。

5方法与步骤

5.1斜面低温保藏法

将要保藏的菌种接种在斜面培养基上,20℃-30℃培养,当菌丝长满斜面时取出,置于4℃冰箱或冰柜中保藏,每隔3-6个月转接1次,具体间隔时间应根据菌种特性确定。

5.1.1保藏设备和材料

4℃冰箱、超净工作台、高压消毒器、菌种培养箱、酒精灯、三角瓶、接种针、试管、培养皿、漏斗、烧杯、吸管、琼脂粉等等。

5.1.2斜面的制备

5.1.2.1器皿的准备

在斜面制备的过程中要用到的一些玻璃器皿,如试管、培养皿、三角瓶、漏斗等,使用前洗净,并于80℃烘干备用。

5.1.2.2培养基的制备

在烧杯中倒入500ml水,按配方称取材料,依次加入水中,逐个溶解,最后定容至1L(在加料过程中,先加缓冲化合物,然后是主要元素、微量元素,最后加维生素等)。冷却至室温,调pH值。然后将琼脂粉加入煮沸的液体培养基中,不断搅拌至融化为止,最后补足蒸发的水分。

5.1.2.3分装

将配好的固体培养基趁热进行分装,装入试管中的培养基不宜超过试管高度的四分之一。在分装过程中,应注意勿使培养基沾污管口,以免弄湿棉塞造成污染。

5.1.2.4灭菌与摆放斜面

将包扎好的培养基灭菌(0.1MPa,30min)。灭菌完毕后摆放斜面时,斜面长度不得超过试管管长的一半。

5.1.2.5无菌检查

将制备好的斜面放入30℃培养箱中培养3天做无菌检查。

5.1.3接种

在超净工作台上,用无菌接种针挑取菌丝体连同少量培养基,接种于适宜的无菌新鲜培养基斜面上,在管壁或小瓶外壁上分别贴好标签标明菌株编号(或名称),然后置于适宜温度的培养箱中培养。

5.1.4培养

培养4-30天后,根据菌落的形态和其它培养特征,判断新培养物是否为原菌种,并注意有无杂菌污染现象。检查无误后,进行保藏。

5.1.5低温保藏

培养好的斜面于4℃-6℃保藏,相对湿度,通常在50%-70%以下。

5.1.6保藏时间

一般3-6个月。

5.1.7菌种的转接

将斜面培养物转接到适宜的新鲜斜面上,在适宜的培养条件下进行培养。

5.1.8菌种的复壮

如果发现菌种有退化现象,应将退化的菌种引入原来的生活环境中使其生长和繁殖,然后再进行纯种分离,例如在宿主体内生长等方法进行复壮。

5.1.9斜面低温保藏法应注意事项

——每次转接时,应仔细核对各菌株的编号、所用培养基等,发现错误立即纠正。

——每次转接培养后,应对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录,检查其培养特征,核实无误后,再行存放。

——斜面低温保藏的菌种,一般每个菌株应保藏相继的三代培养物,以便对照。

5.2液氮超低温保藏法

5.2.1保藏设备和材料

液氮罐、程控降温仪、超净工作台、高压消毒器、菌种培养箱、酒精灯、培养皿、打孔器、安瓿管(圆底硼硅玻璃制品或螺旋口的塑料管),10%甘油或5%或10%的二甲基亚砜、马铃薯、葡萄糖、琼脂粉等。

5.2.2安瓿管的清洗和消毒

安瓿管(2 ml)使用前先用自来水冲洗,再用蒸馏水漂洗,于80℃烘箱烘干。将标签放入安瓿管上部,灭菌(0.103MPa,30min),备用。

5.2.3保护剂的配制和灭菌

一般常用甘油或二甲基亚砜作保护剂。将甘油配成10%的溶液,灭菌(0.1MPa,30min),备用;或二甲基亚砜配成5%或10%的溶液,过滤灭菌,备用。

5.2.4菌种的准备

将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂或综合马铃薯培养基平板上,20℃-28℃下培养,待菌丝长满后,用无菌打孔器从平板上切取大小均匀的小块(直径约5-10mm),转入安瓿管中;或在安瓿管中加1.2-2ml的琼脂培养基,接种,培养2-10天。最后加1.5ml保护剂,封口。

5.2.5冻结

一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好,使样品冻结到-35℃。

目前常用的有三种控温方法

——程控降温法:应用电子计算机程序控制降温装置,可以稳定连续降温,能很好地控制降温速率。

——分段降温法:将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却,或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温,先将安瓿管或塑料小管置于-20℃至-40℃冰箱中1-2小时,然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。

——对耐低温的微生物、可以直接放入气态或液态氮中。

5.2.6保藏

在气相中-150℃,液相中-196℃。

5.2.7保藏时间

一般10年以上。

5.2.8转接方法

从液氮罐中取出安瓿管,立即放入38℃-40℃温水中,快速复苏。为了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,待表面干燥后,用已消毒过的剪刀在安瓿管一端敲开或开启塑料小管,将内容物移至适宜的培养基上,并置于适宜温度的培养箱中进行培养。

5.2.9液氮保藏应注意事项

——  防止冻伤,操作注意安全,戴面罩及皮手套;

——  安瓿管要用圆底的。若用塑料管一定要拧紧管盖;

——  运送液氮时一定要用专用特制的容器,绝不可用密闭容器存放或运输液氮,切勿使用保温瓶存放液氮;

——  注意存放液氮容器的室内通风,防止过量氮气使人窒息;

——  当从液氮容器取出安瓿管时,要特别小心,防止破裂爆炸;

——  注意观察液氮容器中液氮的残存量,定期填充液氮。


参考文献

[1] 李钟庆.微生物菌种保藏技术[M]. 北京:科学出版社,1989

[2] 卯晓岚.中国大型真菌[M]. 郑州:河南科学技术出版社,2000

[3] 邵力平,沈瑞祥,张素轩等.真菌分类学[M]. 北京:中国林业出版社,1984

[4] M.T.马迪根,J.M.马丁克,J.帕克. 微生物生物学[M]. 杨文博等译. 北京:科学出版社,2001

[5] M.J.小佩尔扎等. 微生物学[M]. 武汉大学微生物学教研室译. 北京:科学出版社,1987

[6] 中国科学院微生物研究所. 菌种保藏手册[M]. 北京:中国科学出版社,1980