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【技术规程】植原体菌种保藏技术规程

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国家自然科技资源平台植原体菌种保藏技术规程(试行)


《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组


二〇〇四年十二月十日

目    次


前    言………………………………………………………………………………………2

引    言………………………………………………………………………………………3

1 范围…………………………………………………………………………………………4

2 基本原则………………………………………………………………  …………………4

3 原理…………………………………………………………………………………………4

4 技术要求……………………………………………………………………………………4

5 操作方法与步骤……………………………………………………………………………5

参考文献………………………………………………………………………………………7

前    言

本规程由国家自然科技资源平台建设项目提出。

本规程起草单位:中国农业科学院土壤肥料研究所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国兽医药品监察所、中国食品发酵工业研究院。

本规程主要起草人:田国忠、李永、朴春根、姜瑞波、顾金刚、周宇光、叶强、张月琴、陈敏、程池等。


引    言

植原体是一类无细胞壁的原核微生物,能侵染包括农作物、林木、花卉、杂草等植物,给农、林业生产带来巨大损失,近年来,此类病害在某些重要植物处于蔓延和加重的趋势。这类微生物尚不能在人工培养基上离体培养,其细胞结构、与寄主植物的互作等方面也有其明显不同特点,研究制定此类微生物的保藏技术规程,对于植原体菌种资源的规范和安全保藏、科学研究及合理利用具有重要意义。

植原体菌种保藏技术规程

1 范围

本规程规定了植原体菌种保藏的基本原则、方法及技术要求。

本规程适用于各类植原体菌种的保藏。

2 术语与定义

2.1 

植原体 phytoplasma

指寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物。一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。

2.2 

植物组织培养 plant tissue culture

在无菌的条件下,将离体的植物器官和组织在人工控制的环境下培养,使其再生形成完整植株的过程。培养植原体—植物共生体即是培养已感染植原体病菌的植物外植体。

3 原理

植原体菌种尚不能在离体人工培养基上培养。被感染的寄主植物携带植原体,因而通过对植物茎段的繁殖,即可达到对所携带植原体的繁殖和培养。植物组织培养和营养繁殖,使植原体所受的选择压力较低,较低的温度条件可大大减缓植物和所感染植原体的代谢活动,从而减少菌株突变,降低繁殖速度,有效保持菌种原有性状。

4 技术要求

4.1 保藏方法

   用组织培养法保藏感染植原体的植物组织,于5-25oC温度范围内保藏。

4.2 植物组织培养基

选用适于植物组织正常生长的培养基,不含四环素簇抗生素或其它对植原体生长和繁殖有抑制作用的成分。

4.3 培养温度和光照

培养温度20-28oC为宜。

光照强度在1000-3000 lx,光期为10-14h/d。

4.4 保藏温度和时间

常温保藏(20-28oC),保藏时间1-3个月。

低温保藏(6-10 oC),保藏时间6个月至1年。

注:保藏温度低于4oC会冻伤植物组织材料而导致植原体死亡。

4.5 保藏期检测

定期检查保藏菌种的房间、冷库、冰箱的温度、湿度。

检查各保藏试管有无杂菌污染现象,如发现杂菌污染,则取出该管重新移植,培养后补缺。

4.6 移植复核

大量植原体-植物共生体进行移植时,各菌株的编号、所用培养基需仔细核对无误。每次移植培养后,对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录,核实无误再行存放。

4.7 保藏指标

当获得的组培苗表现典型症状或在荧光显微镜下观察到特异植原体DNA荧光后即可进行菌株的保藏。

5 操作方法与步骤

5.1 带菌外植体采集

在田间采集表现典型症状的新鲜枝条,剪去叶和嫩稍,经酒精和升汞等消毒剂表面消毒后,截成具节茎段,移入培养基上培养。

5.2 无杂菌组培苗的获得

外植体长出新枝后,选无杂菌感染的外植体,截取新枝,移入新配制的培养基上培养和繁殖。如培养基被杂菌污染,将组培苗再进行表面消毒处理,移入新的培养基上培养,重复操作2-3次,直至获得无杂菌组培苗为止。

5.3 组织带菌鉴定

用DAPI荧光显微镜技术和PCR技术鉴定组织带菌状况和浓度。

DAPI荧光显微镜技术步骤:取植物幼茎、叶柄或根等,进行组织切片,厚度在100μm左右,用5%戊二醛固定2小时左右,用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤后,用1μg /ml 4’6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,最后置于落射荧光显微镜下检查韧皮部特异性植原体DNA荧光,激发滤光片波长为365nm,阻断滤光片波长为420nm。

PCR技术步骤:从组织中提取植物和植原体总DNA,用植原体16S rRNA等基因序列的引物进行PCR基因扩增,然后进行琼脂糖电泳,检测特异性扩增产物谱带。

5.4 常温保藏

植原体-植物共生体在适宜的组织培养基上培养,并正常温度和光照下(20-28oC,光照强度在1000-3000 lx)进行保藏,保藏周期为1-3个月。

5.5 低温保藏

将正常温度和光照下(20-28oC,光照强度在1000-3000 lx)培养的植原体-植物共生体移入含组织培养基的试管内,移入6-10oC低温冷藏柜内保藏,1-2个月将试管暴露于正常培养温度和光照条件下补光2-3天,然后存放于低温冷藏柜继续保藏,保藏周期为6个月至1年以上。


参考文献

[1] Sears B.B., Klompararens K.L. Leaf tip cultures of the evening primrose allow stable, aseptic culture of mycoplasma-like organism. Canada Journal of Plant Pathology 11:342-348, 1989.

[2] Jarausch W., Lansac M, Dosba F. Long-term maintenance of nonculturable apple-proliferation phytoplasmas in their micropropagated natural host plant. Plant Pathology 45:778-786, 1996.

[3] 金开璇,田国忠,汪 跃. 组织化学技术快速检测泡桐丛枝病研究[J]. 植物病理学报 19(3):185-188, 1989。

[4]袁巧平,田国忠,黄钦才. 泡桐丛枝病病原MLO在寄主离体培养组织中的保存与增殖[J]. 植物病理学报 24(2):115-120,1994。

[5] 李 永. 我国几种木本植物植原体的分子检测与鉴定[D].中国林业科学院硕士研究生论文,北京,2004。

[6] 田国忠,温秀军,李 永等. 组织培养法繁殖和长期保藏枣疯病和泡桐丛枝病植原体不同分离物的比较研究[J]. 植物病理学研究进展,第五卷,2003, 158-160,北京:中国农业科技出版社。

[7] 李俊明. 植物组织培养教程[M] . 北京:北京农业大学出版社,1992